Systèmes de microscopie recommandés pour les applications d'imagerie spectrale

Imagerie spectrale

Séparez et résolvez clairement vos signaux

Une sélection minutieuse de marqueurs fluorescents, de filtres et de stratégies de tracé multiple au laser vous permet d'obtenir d'excellents résultats pour la majorité des applications d'imagerie de fluorescence. Cependant, le choix des paramètres expérimentaux est souvent limité. L'utilisation de sondes de fluorescence avec des spectres clairement discernables n'est pas toujours possible pour les études de cellules vivantes avec plusieurs marqueurs. L'autofluorescence intrinsèque peut en outre provoquer des artefacts. L'utilisation de fixateurs ou des réactifs de transfection d'ADN peut même augmenter l'autofluorescence à un point où elle excède le signal dans votre image spectrale. Pour éviter ce type de problème, utilisez l'imagerie spectrale couplée avec le démixage linéaire (linear unmixing) pour séparer les signaux fluorescents et résoudre plus clairement la contribution spatiale de chaque fluorophore. Cette technique d'imagerie spectrale est souvent appelée aussi « emission fingerprinting ».

Imagerie spectrale – La fusion de la spectroscopie et de l'imagerie

Avec l'imagerie spectrale, vous fusionnez les deux technologies éprouvées de la spectroscopie et de l'imagerie. En utilisant cette approche, vous acquérez des piles lambda qui peuvent être considérés comme une collection d'images dont chacune est mesurée sur une bande étroite de longueurs d'onde. Extraordinaire pour sa gamme de prix, le microscope à balayage laser ZEISS LSM 800 permet l'acquisition séquentielle de piles lambda en utilisant un diviseur de faisceau VDS. Avec LSM 800 et LSM 880, vous obtenez même une image spectrale avec de multiples bandes d'émission en parallèle, en utilisant un réseau linéaire de canaux de détection. Et l'innovant détecteur QUASAR vous permet de lire jusqu'à 34 canaux simultanément. Vous faites ainsi l'acquisition d'une pile lambda complète en un seul balayage et minimisez la phototoxicité. L'exceptionnelle suppression du bruit vous permet en outre d'appliquer des techniques de traitement avancées. Les informations contenues dans chaque canal sont maintenue pour une analyse ultérieure.

Démixage linéaire - Séparez les empreintes spectrales :

Le démixage linéaire sépare les informations spectrales cumulées recueillies auprès de votre spécimen échantillon biologique en images individuelles pour chaque fluorophore. Cette opération est réalisée par un algorithme qui compare le contenu spectral de chaque pixel dans votre pile lambda avec des combinaisons cumulées possibles des spectres connus des molécules du fluorophore présentes dans votre échantillon. Une palette de logiciels spécialisés pour le traitement, l'interprétation et la présentation des résultats est mise en œuvre dans la suite d'imagerie numérique ZEN.
Grâce à l'imagerie spectrale et le démixage linéaire, vous résolvez des problèmes dans le caryotype spectral, l'immunofluorescence, l'imagerie des cellules vivantes, la découverte de médicaments et la pathologie des tissus. Détectez et différenciez entre une grande variété de colorants absorbants et des fluorophores, même dans les situations où il se produit un certain degré de chevauchement spectral. Cette possibilité est particulièrement utile pour quantifier les signaux complexes que vous rencontrez dans les examens FRET. L'autofluorescence peut être traitée comme un fluorophore distinct à résoudre du signal qui vous intéresse.

Le didacticiel commence par un spectre cumulé (courbe noire) d'un mélange à 50:50 d'EGFP (courbe rouge) et d'Alexa Fluor 488 (courbe verte) qui est représenté dans la fenêtre spectrale. La contribution de l'intensité de chaque sonde (Ii(?)) à l'intensité totale en fonction de la longueur d'onde (I(?)) est présentée sous le graphique. Pour utiliser le didacticiel, servez-vous des curseurs pour ajuster la contribution du fluorophore A et du fluorophore B entre les positions 0 et 100 %. Les menus déroulants permettent de sélectionner différents fluorophores dans la même région de couleur. La sélection d'un troisième fluorophore dans le menu déroulant inférieur (Fluorophore C) ajoute la possibilité d'examiner les spectres cumulés à trois composantes. La contribution d'un fluorophore particulier dans le modèle à trois composantes peut être verrouillée en cliquant sur l'icône de cadenas à gauche du curseur. Une fois qu'un fluorophore individuel est verrouillé, la contribution des deux fluorophores restants peut être modifiée.

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Didacticiel : Propriétés additives des spectres d'émission
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Produits recommandés pour l'imagerie spectrale :

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