ZEISS Lightsheet 7

Votre microscope à feuillet de lumière pour l’imagerie volumique d’échantillons vivants et transparisés.

 

La recherche en sciences de la vie peut demander de grandes exigences à vos capacités d'imagerie : vous devez parfois imager des organismes, des tissus et des cellules modèles vivants entiers à mesure qu'ils se développent. La microscopie à feuillet de lumière en fluorescence (LSFM) avec son principe d'éclairage unique est idéale pour une imagerie rapide et peu photo-toxique de tels échantillons. La stabilité exceptionnelle du Lightsheet 7 vous permet d'observer des échantillons vivants sur de longues durée, tout en les préservant de la phototoxicité de l’illumination. Le système est également compatible avec l’imagerie de grands échantillons transparisés, tels que des cerveaux de souris entiers, avec une résolution subcellulaire. Adaptez votre Lightsheet 7 avec des optiques, des cuves et des porte-échantillons dédiés pour vous ajuster avec précision à l'indice de réfraction de la méthode de transparisation que vous avez choisie, puis visualisez vos grands échantillons, même des cerveaux de souris entiers. Toute cette flexibilité est possible grâce à ce microscope tout intégré et stable ZEISS.

Le Lightsheet 7 est votre système clé en main, stable et entièrement intégré pour la microscopie de fluorescence à feuillet de lumière (LSFM), vous offrant :

  • Imagerie d’échantillon transparisés

La méthode de transparisation que vous choisirez dépendra du type de tissu que vous imagez, de vos sondes fluorescentes et de la taille de l'échantillon lui-même. Le Lightsheet 7 est conçu pour répondre à toutes ces différentes conditions. Vous pouvez désormais imager des échantillons d'une taille allant jusqu'à 2 cm avec n'importe quel indice de réfraction entre 1,33 et 1,58, et dans presque toutes les solutions de transparisation. Le Lightsheet 7 vous permet d'acquérir des images et des données d'ensemble avec une résolution subcellulaire. Imagez de grands échantillons de tissus, organoïdes, sphéroïdes, organes, cerveaux, organes en développement et autres spécimens transparisés.  

 

C57 BL6J mouse perfused with PBS, CellTracker™ CM-DiI Dye, and 4% PFA. Cleared using iDISCO+ protocol, final RIMS is Ethyl Cinnamate.

Sample Courtesy of:
Erin Diel – Harvard University; Harvard Center for Biological Imaging Room 2052, 16 Divinity Ave, Cambridge, MA 02138, USA

  • Obtenez la meilleure qualité et stabilité d'image

Considérer maintenant l’imagerie LSFM pour explorer un large éventail d'applications et obtenir la meilleure qualité d'image. Les optiques et les portes-échantillons nouvellement conçues vous permettent de vous ajuster parfaitement à l'indice de réfraction. Le nouveau porte-échantillon facilite le montage d'échantillons plus grands. Des outils logiciels intelligents vous aident à régler les paramètres d'imagerie, tels que la position de la feuille de lumière et de l'échantillon, les bons paramètres de zoom, les mosaïques et les positions ainsi que les paramètres de traitement des données. Toutes ces nouvelles fonctionnalités vont de pair avec la fiabilité de la combinaison des optiques à lentilles cylindriques ZEISS avec le dispositif de balayage laser pour générer la feuille de lumière. Ajoutez la technologie brevetée Pivot Scan et obtenez des sections optiques sans artefact avec la meilleure qualité d'imagerie. 

Dedicated optics for your ZEISS Lightsheet 7
  • Observez véritablement le vivant - rapidement et avec sensibilité 

Le Lightsheet 7 intègre désormais les caméras pco.edge sCMOS à grande efficacité quantique pour permettre l'observation des processus biologiques les plus rapides à des niveaux d’illumination plus faible. Vous obtiendrez une vue réelle de vos échantillons sans les effets néfastes de la lumière d'excitation sur leur biologie. Pour les échantillons orientés verticalement et une plus grande rapidité d’acquisition des images, optez pour le détecteur CMOS Axiocam 702. Une cuve pour échantillon spéciale fournit le chauffage, le refroidissement et le CO2 pour maintenir l'environnement parfait pour vos expériences. Ajoutez des vues multiples et des options de synchronisation pour contrôler les périphériques externes. Le Lightsheet 7 est votre microscope à feuillet de lumière idéal pour observer les processus biologiques vivants dans une gamme presque illimitée d'organismes.

Development of Arabidopsis.
Développement d‘Arabidopsis. © S. Valuchova, P. Mikulkova, and K. Riha, CEITEC, Masaryk University, Brno, Czech Republic

Le principe de la microscopie à feuillet de lumière en fluorescence

La microscopie à feuillet de lumière en fluorescence (LSFM) divise l'excitation et la détection de la fluorescence en deux trajets lumineux séparés, l'axe d’illumination étant perpendiculaire à l'axe de détection. Cela signifie que vous pouvez éclairer une seule section mince de l'échantillon à la fois, générant une section optique inhérente en excitant uniquement la fluorescence à partir du plan de mise au point. Aucun sténopé ni traitement d'image n'est requis. La lumière provenant du plan de mise au point est collectée sur les pixels d'une caméra, plutôt que pixel par pixel comme, par exemple, dans les microscopes confocaux ou à balayage laser. La parallélisation de la collection d'images sur une caméra vous permet de collecter des images plus rapidement et avec moins de lumière d'excitation que vous le feriez avec de nombreuses autres techniques de microscope. En résumé, le LSFM combine l'effet de sectionnement optique avec l'acquisition d'images parallèles à partir du plan focal complet. Cela rend l'imagerie 3D extrêmement rapide et très efficace en lumière.

Le découplage de l'optique de détection de l'optique d’illumination permet une excitation de fluorescence avec des lentilles dédiées à faible ouverture numérique, sans sacrifier la résolution de détection et la sensibilité. Cela rend le LSFM idéal pour l'imagerie d'échantillons à l'échelle millimétrique, tels que des organismes en développement ou de grands échantillons de tissus transparisés.

Lightsheet 7 LSFM illumination principle

Le fonctionnement du Lightsheet 7

 

Regarder l’animation pour découvrir la simplicité d’utilisation du Lightsheet 7 pour le positionnement et l’imagerie de vos échantillons.

La technologie brevetée Pivot Scanner

L’illumination homogène

Lorsque la feuille de lumière passe à travers l'échantillon, certaines structures de l'échantillon, par exemples les noyaux, absorberont ou diffuseront la lumière d'excitation. Cela projettera des ombres le long de l'axe d'éclairage, comme vous le voyez sur la figure de gauche. Cet effet se produit dans tous les microscopes à fluorescence, mais l'axe d'illumination dans la microscopie à feuillet de lumière en fluorescence est perpendiculaire à l'axe d'observation et donc cet effet est plus évident. Dans le Lightsheet 7, un scanner à pivot breveté (Pivot Scanner) modifie l'angle de la feuille de lumière vers le haut et vers le bas pendant l'acquisition de l'image. En modifiant l'angle d'illumination, les ombres seront projetées dans différentes directions et la lumière d'excitation atteindra également les régions derrière les structures opaques, comme vous le voyez sur la figure de droite. Ce scanner pivotant breveté est un moyen parfait d'acquérir des images sans artefact et d'améliorer les étapes de traitement et d'analyse en aval. Il est toujours préférable de s'attaquer aux artefacts dès leur origine.

Le ZEISS Lightsheet 7 en action

Néphrologie

Rein de souris transparisé avec le protocole iDISCO et imagé dans du cinnamate d'éthyle avec les objectifs ZEISS Lightsheet 7 5x / 0,16 foc et Clr 20x / 1,0 nd = 1,53. La souris a été perfusée avec de la lectine de tomate conjuguée au DyLight 594 pour visualiser le système vasculaire et les glomérules (rouge). En vert : auto-fluorescence pour visualiser l'anatomie des tissus. L'imagerie 3D d'organes entiers et l'analyse de la taille et du nombre glomérulaires aident à mieux comprendre les mécanismes de diverses maladies rénales, par ex. néphropathie diabétique. Traité avec arivis Vision4D® sur ACQUIFER HIVE.

 

Sample courtesy of U. Roostalu, Gubra, Denmark.

 

Sample courtesy of U. Roostalu, Gubra, Denmark.

Biologie du développement

Ensemble de données 3D d'une trachée de souris P10 affichant l'organisation anatomique des fibres nerveuses mécanosensorielles. Marquage : DAPI, collagène IV (anticorps Alexa 488), fibres sensorielles (souche reporter exprimant tdTomato, anticorps Alexa 555), protéine de neurofilament NF200 (fibres nerveuses myélinisées, anticorps Alexa 647).

L'échantillon a été transparisé dans du PEGASOS (Jing et al:, 2018, Cell Research) imagé dans du BB-PEG à RI de 1,54 avec les objectifs foc 5x / 0,16 et Cl r 20x / 1,0 nd = 1,53. Ensemble de données au grandissement 5x: échelle de pixels 0,61 × 0,61 × 1,63 micron, mosaïque 3 × 3, zoom 1,5x, 1230 sections en z, volume 2,57 × 2,58 × 2 mm. Ensemble de données au grandissement 20x: échelle de pixels 0,23 μm × 0,23 × 0,58 micron, mosaïque 1 × 5, Zoom 1,0 ×, 4206 sections en z, volume 2,0 × 0,45 × 1,82 mm.

 
 

Sample courtesy of P.-L. Ruffault, C. Birchmeier, Laboratory of Developmental Biology / Signal Transduction; A. Sporbert, M. Richter Advanced Light Microscopy; M. Delbrück, Center for Molecular Medicine, Berlin, Germany.

Membre d’un vertébré, régénération de la moelle épinière

La salamandre a la capacité remarquable de régénérer ses membres et sa moelle épinière. Les outils de génétique moléculaire permettent d'identifier les cellules souches responsables de cette régénération complexe et les signaux sensibles aux blessures qui déclenchent leur prolifération. Cet avant-bras axolotl a été transparisé dans du cinnamate d'éthyle (Masselink, W. et al. Development 146, (2019)) et imagé avec un objectif 5x / 0,16 foc à un indice de réfraction de 1,57. L'ensemble de données multi-mosaïque a été aligné, fusionné et rendu avec le logiciel d'imagerie ZEN et le logiciel arivis Vision4D® sur une plateforme de données ACQUIFER HIVE.

 

Sample courtesy of W. Masselink, Tanaka lab, Research Institute of Molecular Pathology, IMP.
Image courtesy of P. Pasierbek, K. Aumayr, IMP BioOptics, Vienna, Austria.

Morphologie neuronale

L'imagerie de cellules entières dans le cerveau humain est une tâche presque impossible, en raison de la morphologie extrêmement sophistiquée des neurones et de leur propagation dans tout l'organe. Les organoïdes permettent dans une certaine mesure de récapituler le cerveau humain, y compris la production de neurones à partir de cultures de cellules souches neuronales. Avec la compensation ECi, la morphologie neuronale peut être étudiée du niveau local au niveau global, ce qui ouvre des possibilités intéressantes pour l'étude de la morphologie neuronale en 3D.

Organoïdes neuronaux de 35 jours faiblement marqués avec GFP / tdtomato (3% GFP et 3% tdtomato) imagés avec un objectif Clr 20 × / 1,0 nd = 1,53. Echelle de pixels: 222 × 222 × 567 nm. Volume de l’image: 1,66 × 0,66 × 1,6 mm.

 

Sample courtesy of D. Reumann and J. Knoblich, IMBA, Vienna, Austria.

Immunologie

L'imagerie d'organes lymphoïdes intacts en 3D permet d'analyser et de quantifier la réponse immunitaire à l'infection virale. Les cellules T ont été transférées dans des souris hôtes de type sauvage avant la récolte. Le nœud a été nettoyé, fixé et dégagé à l'aide de Ce3D (Li et al. PNAS 163, 2017) avant l'imagerie à RI = 1,49 (ph 7) avec un objectif 5x / 0,16 (volume 2,5 × 2,5 × 1,6 mm). L'image montre des cellules T CD8 + natives marquées GFP (jaune), des follicules de cellules B sont marquées en utilisant du B220 (cyan) et le réseau vasculaire du CD31 (magenta).

Inguinal mouse Lymph node

Sample Courtesy of Joanna Groom, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, Australia

Cartographie du système vasculaire du cerveau entier de la souris

Une souris C57 BL6J a été perfusée avec du PBS et 4% de PFA. Le cerveau a été coloré en perfusant le colorant Cell-Tracker ™ CM-DiI - un colorant lipidique pour membranes vasculaires. L'échantillon a été transparisé en utilisant le protocole iDISCO +, équilibré dans du cinnamate d'éthyle en tant que RIMS final. Il a ensuite été imagé dans du cinnamate d'éthyle à RI = 1,565 avec un objectif Fluar 2,5 × / 0,12 dans une cuve Translucence Mesoscale Imaging Chamber.

L'image à haute résolution sur la droite a été acquise avec Clr Plan-Neofluar 20 × / 1,0 Corr nd = 1,53. Le volume d'imagerie est de 13,1 × 13,1 × 6 mm à une résolution de pixels de 1,83 × 1,83 × 6,77 μm. Il a été acquis en environ 40 minutes en mosaïque de 4 × 4, et 866 sections en z. Le volume de données est de 93 Go. Données traitées avec le logiciel d'imagerie ZEN et arivis Vision4D® sur une plateforme de données ACQUIFER HIVE. 

 
 

Sample courtesy of E. Diel, D. Ric hardson, Harvard University, Cambridge, USA.

Cartographie des interneurones et des cellules de Purkinje du cerveau entier de souris

Le cerveau de souris PV-tdtomato a été transparisé en utilisant le protocole CLARITY avec une imagerie finale effectuée dans du EasyIndex à un indice de réfraction de RI = 1,46.
Le parvalbumine-Cre résulte de l'expression du marqueur tdtomato - La parvalbumine est exprimée dans une population d'interneurones dans le cerveau et dans les cellules de Purkinje dans le cervelet. L'ensemble des données du cerveau a été acquis sur un ZEISS Lightsheet 7 avec un objectif 5x / 0,16 foc. Le volume d'imagerie est de 11 × 20 × 8,8 mm à une résolution de pixels de 0,91 × 0,91 × 5,35 μm (12028 × 22149 × 1621 voxels). Il a été acquis en mosaïque 6 × 10, 1621 sections en z. Le volume de données est de 1,2 To (805 Go après l'assemblage). Les données ont été traitées avec le logiciel d'imagerie ZEN et arivis Vision4D® sur une plateforme de données ACQUIFER HIVE.

 

Sample courtesy of E. Diel, D. Ric hardson. Harvard University, Cambridge, USA.

Téléchargements

ZEISS Lightsheet 7

Light sheet fluorescence microscopy for Multiview imaging of living and cleared specimens.

Page: 26
Volume de fichier: 8850 kB

ZEISS Lightsheet 7

Light sheet fluorescence microscopy for Multiviewimaging of living and cleared specimens.

Page: 4
Volume de fichier: 1871 kB

Technology Note: A Methodology Review

How to Get Better Fluorescence Images with Your Widefield Microscope.

Page: 11
Volume de fichier: 1885 kB

Technology Note: ZEISS Lightsheet 7

How to Get Best Images with Various Types of Immersion Media and Clearing Agents

Page: 10
Volume de fichier: 2077 kB

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