ZEISS Correlative Cryo Workflow

Votre solution pour la préparation de lamelles TEM et l'imagerie en volume dans des conditions cryogéniques

La microscopie cryogénique permet l'examen de structures cellulaires dans un état proche de leur état d'origine, puisque l'ultrastructure des cellules et des tissus peut être préservée sans artéfacts et les processus cellulaires sont arrêtés instantanément. Cependant, la microscopie cryogénique présente des défis complexes pour les utilisateurs, tels que les longues procédures de préparation et d'imagerie, la dévitrification, la contamination par la glace ou la perte d'échantillons, ainsi que les contraintes supplémentaires qui s'imposent si vous désirez corréler les données obtenues à travers les différentes modalités d'imagerie.

ZEISS Correlative Cryo Workflow associe la microscopie électronique à balayage laser et à balayage par faisceau d'ions focalisé lors d'une procédure transparente et facile à mettre en place. La solution comprend un équipement et un logiciel optimisés pour les besoins des workflows cryogéniques corrélatifs : de la localisation des macromolécules fluorescentes à l'imagerie volumique à fort contraste en passant par l'amincissement des lamelles sur grille pour la tomographie cryoélectronique.

Accessoires du Correlative Cryo Workflow

Imagerie d'échantillons proches de leur état d'origine

  • Un workflow cryogénique transparent à travers de multiples modalités
  • Protection des échantillons contre la dévitrification et la contamination par la glace
  • Imagerie de fluorescence en haute résolution
  • Imagerie volumique à fort contraste et reconstruction 3D
  • Amincissement ciblé des lamelles sur grille pour les applications cryogéniques TEM
  • Utilisation polyvalente pour des applications cryogéniques et à température ambiante

Un workflow simplifié pour vous aider à vous concentrer sur vos recherches

Avec ZEISS Correlative Cryo Workflow, vous maîtrisez la difficile combinaison de multiples modalités d'imagerie en conditions cryogéniques. La solution associe la microscopie optique et électronique au service de l'imagerie volumique et de la production efficace de lamelles TEM. Des accessoires dédiés simplifient le workflow et facilitent le transfert des échantillons cryogéniques d'un microscope à l'autre en toute sécurité. La gestion des données est assurée par ZEN Connect, qui conserve vos données dans leur contexte tout au long du workflow. Une gamme d'outils de traitement vous aident à améliorer les résultats de l'imagerie.

Correlative Cryo Workflow en laboratoire
Cellules de levure à marquage double (CNM67-tdTomato et NUP-GFP).
Cellules de levure à marquage double (CNM67-tdTomato et NUP-GFP). Image du microscope à balayage laser (à gauche) et image Crossbeam (à droite). Échantillon : avec l'aimable autorisation de M. Pilhofer, ETH, Zurich, Suisse

Des composants de qualité supérieure pour une qualité de données sans égale

Grâce à leurs objectifs cryo-compatibles et à la haute sensibilité du détecteur Airyscan, les systèmes de microscope à balayage laser ZEISS vous permettent de détecter les protéines et les structures cellulaires à haute résolution, tandis que l'illumination à faible phototoxicité et des températures basses constantes empêchent la dévitrification de vos échantillons. Le Crossbeam FIB-SEM de ZEISS vous permet de bénéficier d'une imagerie volumique à fort contraste, sans même qu'il soit nécessaire d'appliquer une coloration à base de métaux lourds sur vos échantillons. Les deux modalités fournissent des informations fonctionnelles et structurelles précieuses pour une compréhension approfondie de l'ultrastructure, que vous poursuiviez ou non vos observations au microscope électronique en transmission (TEM).

Des solutions polyvalentes pour maintenir la productivité de votre système d'imagerie

Contrairement aux autres solutions, les microscopes ZEISS impliqués dans le workflow peuvent être utilisés non seulement pour la microscopie cryogénique, mais aussi pour des applications à température ambiante. Cette spécificité est particulièrement avantageuse lorsque les microscopes ne sont pas utilisés exclusivement pour des expériences cryogéniques. Le passage de l'observation en conditions cryogéniques à l'observation à température ambiante se fait rapidement et ne nécessite aucune expertise technique. Cette flexibilité permet aux utilisateurs de consacrer davantage de temps à leurs expériences. Les systèmes d'imagerie sont ainsi utilisés plus souvent et le retour sur investissement est plus rapide.

Installation d'imagerie de base avec équipement Cryo

ZEISS Correlative Cryo Workflow en bref

Workflow cryogénique corrélatif

Avantages

Évaluation de la qualité de l'échantillon et prévention de sa dégradation

La perte d'échantillons, la contamination par la glace et la dévitrification sont des problèmes bien connus en cryo-microscopie. ZEISS Correlative Cryo Workflow est conçu pour protéger vos précieux échantillons vitrifiés afin qu'ils ne soient pas endommagés au cours de ce protocole exigeant.

Le kit d'accessoires ZEISS Cryo ainsi que les capacités d'imagerie du microscope à balayage laser ZEISS/Airyscan et du ZEISS Crossbeam réduisent le risque de perte ou de destruction de votre échantillon lorsque vous travaillez dans des conditions cryogéniques.

Avant même de gérer votre échantillon dans le workflow, la vitrification est déjà un défi en soi. Malgré le développement récent des technologies de vitrification, les échantillons sont encore souvent recouverts d'une épaisse couche de glace ou seulement partiellement vitrifiés et présentent des zones de glace non amorphe. Une mauvaise vitrification détruit l'ultrastructure des cellules et des tissus. Ces zones ne peuvent être identifiées que dans un TEM, à moins que votre microscope optique ou le FIB-SEM ne fournisse des méthodes d'évaluation des échantillons au début du workflow.

Les microscopes à balayage laser ZEISS offrent cette capacité d'évaluation en permettant différentes méthodes de contraste. L'excellente performance de contraste du ZEISS Crossbeam permet également une évaluation fiable de la qualité de l'échantillon. Vous gagnerez du temps et améliorerez le rendement de vos expériences.

Supports HPF avec échantillons vitrifiés
Supports HPF avec échantillons vitrifiés (cliquez pour plus d'informations)
Grilles TEM avec échantillons vitrifiés.
Grilles TEM avec échantillons vitrifiés. (cliquez pour plus d'informations)

Mesure de l'épaisseur de la glace et ciblage efficace de la région d'intérêt

La mesure de l'épaisseur de la glace est cruciale pour juger de la qualité des échantillons et pour localiser les cellules d'intérêt dans le spécimen vitrifié. Grâce au microscope optique, votre échantillon peut être validé facilement. La lumière réfléchie et l'imagerie confocale par fluorescence donnent les premiers indices sur la qualité et permettent de localiser clairement les cellules prometteuses.

Les motifs flous en toile d'araignée du signal fluorescent indiquent souvent une congélation défectueuse. En outre, les échantillons congelés en plongée présentent une qualité de congélation et une conservation inégales dans un même échantillon. Les informations sur l'épaisseur et la qualité de la glace permettent de présélectionner rapidement les cellules avant de passer à l'étape suivante dans le workflow cryogénique corrélatif.

Cellules Hela congelées en plongée (marquées par l'histone 2-GFP) illustrant les conditions idéales pour la poursuite de l'imagerie. La couche de glace a une épaisseur d'environ 6,8 μm et recouvre les cellules vitrifiées. Ces cellules sont parfaitement adaptées à une analyse FIB-SEM plus poussée.

Aperçu de la solution

Kit d'accessoires ZEISS Cryo

ZEISS Correlative Cryo Workflow permet l'utilisation de différents porte-échantillons. Que vous utilisiez des grilles TEM, AutoGrid, des disques de saphir ou des planches HPF, vous pouvez compter sur le kit d'accessoires cryogéniques pour faciliter le chargement, le transfert et le stockage de votre échantillon. Un ensemble d'éléments et d'outils permet une manipulation sûre des échantillons tout au long du processus. Les composants sont compatibles avec :

  • platine de microscopie corrélative Linkam CMS196V³
  • système cryogénique Quorum PP3010Z
Kit d'accessoires ZEISS Cryo
Kit d'accessoires ZEISS Cryo

Transfert aisé et manipulation sûre des échantillons à l'intérieur du ZEISS Crossbeam

ZEISS Correlative Cryo Workflow est livré avec Quorum PP3010Z, un système de préparation cryogénique hautement automatisé, facile à utiliser et refroidi au gaz.

  • La chambre de préparation cryogénique à pompage turbomoléculaire comprend des outils pour la sublimation et le revêtement par pulvérisation cathodique contrôlés et automatiques.
  • De la chambre de préparation cryogénique reliée directement à la chambre du ZEISS Crossbeam, l'échantillon vitrifié est transféré sur une platine froide très stable pour l'imagerie et l'usinage.
  • Le piégeage froid dans la chambre de cryopréparation et la chambre du Crossbeam protège l'échantillon de la contamination par la glace.
  • Le refroidissement continu pendant au moins 24 heures est assuré par le système de refroidissement hors colonne CHE3010.
  • Tous les composants cryogéniques de Quorum sont contrôlés par la station de travail Prepdek®, y compris le tube de stockage sous vide pour le dispositif de transfert cryo et le prep slusher du TEM pour la station de chargement ZEISS.
ZEISS Crossbeam : sous-platine cryogénique rotative
ZEISS Crossbeam : sous-platine cryogénique rotative

Les modalités d'imagerie les plus fiables combinées

Microscopie confocale et à grand champ cryogénique

Microscopie cryogénique à grand champ et confocale :
ZEISS Axio Imager / ZEISS LSM 900/980 avec Airyscan 2
ZEISS Axio Imager, le microscope optique de choix pour le ZEISS Correlative Cryo Workflow, peut être équipé de la platine cryogénique CMS196V3 de Linkam. En fonction de vos besoins, vous pouvez configurer l'Axio Imager comme :

  • un système à grand champ (avec Apotome 3 pour acquérir des ensembles de données 3D)
  • un LSM 900/980 avec Airyscan 2 pour l'imagerie confocale haute résolution

Le matériel est conçu pour empêcher la dévitrification et la contamination par la glace pendant la phase d'imagerie. Les objectifs disponibles vont de 5x à 100x pour prendre en charge l'acquisition d'images depuis la vue d'ensemble à faible grossissement jusqu'aux images haute résolution. Les différentes méthodes d'éclairage, comme le mode de lumière réfléchie ou transmise, permettent d'étudier votre échantillon sous différents angles pour fournir des informations supplémentaires sur l'épaisseur de la glace et la qualité de l'échantillon. Grâce au détecteur sensible Airyscan, qui permet un éclairage non agressif, l'imagerie cryogénique haute résolution devient possible.

Le microscope à balayage laser et le microscope à grand champ sont des outils polyvalents qui peuvent être convertis rapidement pour les expériences cryogéniques ou pour les expériences à température ambiante sans compromettre la qualité de l'image.

Imagerie en volume par MEB cryogénique et préparation de lamelles

Imagerie en volume par MEB cryogénique et préparation de lamelles TEM :
ZEISS Crossbeam 350/550/550L
La technologie FIB-SEM est bien établie dans diverses disciplines, mais elle a également fait son chemin dans les sciences de la vie, à la fois comme outil de coupe des échantillons biologiques de haute précision et pour ses capacités d'imagerie idéales pour dévoiler l'ultrastructure.

ZEISS Crossbeam a été conçu pour vous offrir une grande facilité d'utilisation et un excellent contraste d'image. Même avec des échantillons vitrifiés non colorés, ce FIB-SEM génère des images très contrastées à des températures cryogéniques, ce qui permet d'étudier l'ultrastructure des cellules et des tissus, et de rendre les compartiments cellulaires clairement visibles.

En général, les faibles tensions d'accélération requises pour l'imagerie MEB cryogénique s'accompagnent d'un contraste faible. ZEISS Crossbeam génère un contraste élevé même à de faibles tensions d'accélération, grâce à l'interaction unique entre l'optique électronique Gemini et les détecteurs. Cette configuration permet également d'observer la procédure d'imagerie et d'usinage en temps réel – vous pouvez contrôler précisément le processus d'usinage et assurer un amincissement ciblé des lamelles TEM ultrafines sur grille.

ZEISS Crossbeam peut être utilisé comme un outil polyvalent sans faire de compromis sur les performances.

Regrouper tous les éléments : un logiciel sur mesure

Afin de garantir un workflow cryogénique corrélatif fluide et un fonctionnement transparent entre les différents composants, les plateformes logicielles concernées ont été étendues pour inclure des fonctions spécifiques à la microscopie cryogénique. Des modules logiciels supplémentaires ont été développés pour relever les défis posés par la microscopie cryogénique corrélative.

  • ZEISS ZEN
  • ZEISS ZEN Connect
  • Boîte à outils de traitement ZEN EM
  • SmartSEM et SmartFIB
  • Réduction de la dérive cryogénique
Ensemble de données cryogéniques corrélatives dans ZEISS ZEN Connect
Ensemble de données cryogéniques corrélatives dans ZEISS ZEN Connect

Applications

ZEISS Correlative Cryo Workflow au travail

Biologie cellulaire : identification d'événements rares

Les corps polaires du fuseau sont difficiles à localiser dans les cellules de levure. Il s'agit de petites structures qui se produisent rarement. ZEISS Correlative Cryo Workflow vous permet d'identifier et de capturer des images précises de ces structures cellulaires pratiquement dans leur état d'origine. Le microscope à balayage laser avec le détecteur Airyscan, facilite encore davantage l'identification de ces structures, permettant ainsi d'obtenir des images plus détaillées. Toutes les images – depuis une large vue d'ensemble de la cellule entière jusqu'aux images haute résolution de ces minuscules structures – sont organisées dans un projet ZEN Connect, contenant toutes les données nécessaires pour relocaliser ces structures cellulaires dans le FIB-SEM.

En utilisant le Crossbeam, les lamelles TEM des régions identifiées peuvent être préparées pour la tomographie électronique cryogénique. L'imagerie en volume est également possible. De plus, la solution de workflow vous permet de reconnecter toutes les données après l'acquisition d'images. Les images du Crossbeam ou les tomogrammes du TEM peuvent être combinés avec les données du microscope à balayage laser et peuvent être représentés dans un contexte tridimensionnel.

Cellules de levure marquées avec NUP (complexe de pores nucléaires)-GFP et CNM67-tdTomato.
Échantillon et tomogramme : avec l'aimable autorisation de M. Pilhofer, ETH Zürich, Suisse

Ensemble de données de module laser et EM : de l'aperçu en grille à l'identification de la région d'intérêt pour la poursuite de la tomographie TEM
Image FIB de la lamelle préparée. Épaisseur de la lamelle : 230 nm
Image FIB de la lamelle préparée. Épaisseur de la lamelle : 230 nm
Tomogramme segmenté et reconstitué

Biologie cellulaire : imagerie volumique 3D corrélative

Une fois que les structures cellulaires, telles que les corps polaires du fuseau, sont identifiées dans le système du microscope à balayage laser, la qualité d'imagerie supérieure du ZEISS Crossbeam permet de cibler et d'analyser l'ultrastructure à l'aide de l'imagerie volumique cryogénique. Même avec de faibles tensions d'accélération, le Crossbeam permet une imagerie à fort contraste des échantillons vitrifiés et non colorés tout en protégeant l'échantillon contre les risques de dégradation. Les images haute résolution acquises avec le microscope à balayage laser et les images à fort contraste du Crossbeam permettent une superposition simple et précise des images. Lorsque la région d'intérêt est relocalisée dans le Crossbeam à l'aide de ZEN Connect, l'acquisition d'ensembles de données en 3D des cellules identifiées est terminée. Deux corps polaires du fuseau ont été ciblés dans le volume corrélatif. L'orientation des microtubules individuels devient clairement visible sur les images à fort contraste selon la direction de coupe du FIB. D'autres compartiments cellulaires ont pu être identifiés dans le volume en 3D.

Échantillon : avec l'aimable autorisation de M. Pilhofer, ETH, Zurich, Suisse

Superposition d'une image microscope à balayage laser/Airyscan haute résolution avec une image Crossbeam très contrastée acquise en conditions cryogéniques. La superposition a été réalisée avec ZEN Connect.
Reconstruction en volume 3D des cellules de levure et de la segmentation du noyau (bleu foncé) ainsi que de plusieurs mitochondries.
Corps polaire du fuseau en coupe longitudinale
Corps polaire du fuseau en coupe longitudinale à l'intérieur de la membrane nucléaire (en haut) et microtubules en coupe transversale à l'extérieur de la membrane nucléaire (en bas). Taille d'incrément de l'image de la pile acquise : 50 nm

Recherche sur le cancer

Les cellules cancéreuses présentent un fort phénotype de fission mitochondriale qui explique potentiellement leur résistance aux médicaments. Les méthodes de fixation chimique créent souvent des artéfacts, tels que l'accumulation de mitochondries, qui pourraient être interprétés par erreur comme des événements de fission. La fixation par cryogénie permet d'éviter ces artéfacts et de préserver les échantillons dans un état proche de leur état d'origine.

L'exemple montre des cellules d'adénocarcinome gelées en plongée, sur des disques de saphir. Les données du microscope à balayage laser mettent déjà en évidence un réseau mitochondrial dense avec une fission accrue, confirmée ensuite par les données du Crossbeam. Après l'imagerie avec le microscope à balayage laser et l'Airyscan, l'échantillon vitrifié a été transféré sur le Crossbeam. ZEN Connect a été utilisé pour localiser les régions d'intérêt, pour superposer les ensembles de données respectifs après l'acquisition, et pour organiser toutes les images acquises.

Cellules d'adénocarcinome congelées en plongée et cultivées sur des disques de saphir.
Cellules d'adénocarcinome congelées en plongée et cultivées sur des disques de saphir. Toutes les régions d'intérêt sont présentées en contexte dans ZEN Connect.
Ensemble de données 3D d'une cellule d'adénocarcinome montrant un schéma prononcé de fission mitochondriale.
Ensemble de données 3D d'une cellule d'adénocarcinome montrant un schéma prononcé de fission mitochondriale.
Réseau auto-segmenté de mitochondries dans un sous-volume d'un ensemble de données Crossbeam.

Biologie végétale

La réponse des plantes face aux changements des conditions environnementales, comme l'augmentation de la salinité, est un sujet de recherche important dans le domaine de la biologie végétale. Les plantes présentent souvent des réactions de stress lorsqu'elles font face à ces conditions changeantes. L'un des effets observables au niveau de l'ultrastructure est la formation de stromules, de longues extensions tubulaires dans les plastides.

Le projet ZEN Connect montre des images issues de différentes modalités d'imagerie : le microscope à balayage laser a été utilisé pour localiser les stomates et les plastides internalisés à l'aide de l'autofluorescence de l'échantillon. Après une relocalisation réussie de la région d'intérêt, l'image du microscope à balayage laser a été superposée à une image d'ensemble MEB de la stomie sélectionnée. Une pile d'images FIB de la stomie a été acquise. L'ensemble de données EM a révélé une augmentation de la formation de stromules dans les plastides.

Échantillon : avec l'aimable autorisation de B. Franzisky, Université Hohenheim, Allemagne

Les stomates et les plastides internalisés ont été identifiés avec un microscope à balayage laser grâce à l'autofluorescence de l'échantillon.
Les stomates et les plastides internalisés ont été identifiés avec un microscope à balayage laser grâce à l'autofluorescence de l'échantillon. La stomie sélectionnée a été relocalisée et imagée avec le Crossbeam.
Les stromules sont clairement visibles dans les plans de coupe acquis avec le Crossbeam.
Les stromules sont clairement visibles dans les plans de coupe acquis avec le Crossbeam.
La reconstruction 3D et la segmentation de la pile d'images du FIB révèlent la morphologie des plastides. La reconstruction montre des stromules en interaction étroite avec les mitochondries.

Biologie du développement : étude des cellules mitotiques chez le caenorhabditis elegans

Des vers caenorhabditis elegans entiers ont été fixés par HPF et des images des cellules embryonnaires en métaphase ont été capturées in situ par microscopie de fluorescence cryogénique. Les vers sélectionnés ont ensuite été colorés au métal lourd par substitution de gel, encapsulés dans de la résine et sectionnés afin que le même volume puisse être localisé et saisi en image haute résolution, avec un contraste élevé, par le Crossbeam. Grâce à ce workflow, la métaphase ciblée a pu être reconstruite avec succès. En outre, cette approche a entraîné des découvertes fortuites : un signal de fluorescence adjacent ponctuel et intrigant a pu être corrélé à un autophagosome présumé.

Ainsi, la microscopie à cryofluorescence d'échantillons épais, congelés sous haute pression, peut être utilisée pour piéger et imager des structures cellulaires transitoires dans un état proche de leur état natif ; un traitement approprié et une imagerie EM en volume, corrélative ultérieure permettent ensuite la reconstruction de ces architectures ciblées à haute résolution et en 3D.

Avec l'aimable autorisation de Kedar Narayan, National Cancer Institute / NIH et Frederick National Laboratory for Cancer Research, États-Unis

Haut : une image du ver a été capturée à température cryogénique avec un système de microscope à balayage laser / Airyscan avant la substitution du gel. Bas : une image du ver incrusté et coloré a ensuite été capturée avec un Crossbeam.
Haut : une image du ver a été capturée à température cryogénique avec un système de microscope à balayage laser / Airyscan avant la substitution du gel. Bas : une image du ver incrusté et coloré a ensuite été capturée avec un Crossbeam.
Reconstruction de structures cellulaires, telles qu'un autophagosome (AP) ou le génome en différentes phases mitotiques (*cellule en métaphase, #cellule en télophase).
Reconstruction de structures cellulaires, telles qu'un autophagosome (AP) ou le génome en différentes phases mitotiques (*cellule en métaphase, #cellule en télophase).
Reconstruction en 3D de structures cellulaires

Téléchargements

ZEISS Correlative Cryo Workflow

Your Solution for TEM Lamella Preparation and Volume Imaging under Cryogenic Conditions

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