ZEISS Correlative Cryo Workflow

Les corps polaires du fuseau sont difficiles à localiser dans les cellules de levure. Il s'agit de petites structures qui se produisent rarement. ZEISS Correlative Cryo Workflow vous permet d'identifier et de capturer des images précises de ces structures cellulaires pratiquement dans leur état d'origine. Le microscope à balayage laser avec le détecteur Airyscan, facilite encore davantage l'identification de ces structures, permettant ainsi d'obtenir des images plus détaillées. Toutes les images – depuis une large vue d'ensemble de la cellule entière jusqu'aux images haute résolution de ces minuscules structures – sont organisées dans un projet ZEN Connect, contenant toutes les données nécessaires pour relocaliser ces structures cellulaires dans le FIB-SEM.

En utilisant le Crossbeam, les lamelles TEM des régions identifiées peuvent être préparées pour la tomographie électronique cryogénique. L'imagerie en volume est également possible. De plus, la solution de workflow vous permet de reconnecter toutes les données après l'acquisition d'images. Les images du Crossbeam ou les tomogrammes du TEM peuvent être combinés avec les données du microscope à balayage laser et peuvent être représentés dans un contexte tridimensionnel.

Cellules de levure marquées avec NUP (complexe de pores nucléaires)-GFP et CNM67-tdTomato.
Échantillon et tomogramme : avec l'aimable autorisation de M. Pilhofer, ETH Zürich, Suisse

Une fois que les structures cellulaires, telles que les corps polaires du fuseau, sont identifiées dans le système du microscope à balayage laser, la qualité d'imagerie supérieure du ZEISS Crossbeam permet de cibler et d'analyser l'ultrastructure à l'aide de l'imagerie volumique cryogénique. Même avec de faibles tensions d'accélération, le Crossbeam permet une imagerie à fort contraste des échantillons vitrifiés et non colorés tout en protégeant l'échantillon contre les risques de dégradation. Les images haute résolution acquises avec le microscope à balayage laser et les images à fort contraste du Crossbeam permettent une superposition simple et précise des images. Lorsque la région d'intérêt est relocalisée dans le Crossbeam à l'aide de ZEN Connect, l'acquisition d'ensembles de données en 3D des cellules identifiées est terminée. Deux corps polaires du fuseau ont été ciblés dans le volume corrélatif. L'orientation des microtubules individuels devient clairement visible sur les images à fort contraste selon la direction de coupe du FIB. D'autres compartiments cellulaires ont pu être identifiés dans le volume en 3D.

Échantillon : avec l'aimable autorisation de M. Pilhofer, ETH, Zurich, Suisse

Les cellules cancéreuses présentent un fort phénotype de fission mitochondriale qui explique potentiellement leur résistance aux médicaments. Les méthodes de fixation chimique créent souvent des artéfacts, tels que l'accumulation de mitochondries, qui pourraient être interprétés par erreur comme des événements de fission. La fixation par cryogénie permet d'éviter ces artéfacts et de préserver les échantillons dans un état proche de leur état d'origine.

L'exemple montre des cellules d'adénocarcinome gelées en plongée, sur des disques de saphir. Les données du microscope à balayage laser mettent déjà en évidence un réseau mitochondrial dense avec une fission accrue, confirmée ensuite par les données du Crossbeam. Après l'imagerie avec le microscope à balayage laser et l'Airyscan, l'échantillon vitrifié a été transféré sur le Crossbeam. ZEN Connect a été utilisé pour localiser les régions d'intérêt, pour superposer les ensembles de données respectifs après l'acquisition, et pour organiser toutes les images acquises.

La réponse des plantes face aux changements des conditions environnementales, comme l'augmentation de la salinité, est un sujet de recherche important dans le domaine de la biologie végétale. Les plantes présentent souvent des réactions de stress lorsqu'elles font face à ces conditions changeantes. L'un des effets observables au niveau de l'ultrastructure est la formation de stromules, de longues extensions tubulaires dans les plastides.

Le projet ZEN Connect montre des images issues de différentes modalités d'imagerie : le microscope à balayage laser a été utilisé pour localiser les stomates et les plastides internalisés à l'aide de l'autofluorescence de l'échantillon. Après une relocalisation réussie de la région d'intérêt, l'image du microscope à balayage laser a été superposée à une image d'ensemble MEB de la stomie sélectionnée. Une pile d'images FIB de la stomie a été acquise. L'ensemble de données EM a révélé une augmentation de la formation de stromules dans les plastides.

Échantillon : avec l'aimable autorisation de B. Franzisky, Université Hohenheim, Allemagne

Des vers caenorhabditis elegans entiers ont été fixés par HPF et des images des cellules embryonnaires en métaphase ont été capturées in situ par microscopie de fluorescence cryogénique. Les vers sélectionnés ont ensuite été colorés au métal lourd par substitution de gel, encapsulés dans de la résine et sectionnés afin que le même volume puisse être localisé et saisi en image haute résolution, avec un contraste élevé, par le Crossbeam. Grâce à ce workflow, la métaphase ciblée a pu être reconstruite avec succès. En outre, cette approche a entraîné des découvertes fortuites : un signal de fluorescence adjacent ponctuel et intrigant a pu être corrélé à un autophagosome présumé.

Ainsi, la microscopie à cryofluorescence d'échantillons épais, congelés sous haute pression, peut être utilisée pour piéger et imager des structures cellulaires transitoires dans un état proche de leur état natif ; un traitement approprié et une imagerie EM en volume, corrélative ultérieure permettent ensuite la reconstruction de ces architectures ciblées à haute résolution et en 3D.

Avec l'aimable autorisation de Kedar Narayan, National Cancer Institute / NIH et Frederick National Laboratory for Cancer Research, États-Unis