ZEISS LSM 980 avec Airyscan 2

Votre microscope confocal nouvelle génération pour une imagerie Multiplex rapide et non invasive

Observer la vie en générant le moins de perturbations possible nécessite une faible densité de marquage de vos modèles biologiques - par exemple, une culture cellulaire 3D, des sphéroïdes, des organoïdes ou même des organismes complets. Cette nécessité appelle à son tour une imagerie en 3D alliant un sectionnement optique à une faible phototoxicité et à une grande vitesse d'exécution. Vous devez ensuite répéter les expériences en vue d'obtenir des données statistiquement valides pour vos conclusions : très vite, il devient évident qu'un rendement élevé sera également indispensable.

Le microscope à balayage laser LSM 980 avec Airyscan 2 est la plateforme idéale pour votre imagerie confocale 4D. Elle est optimisée pour la détection spectrale simultanée de plusieurs marqueurs faibles jusqu'à 900 nm d'émission avec la meilleure efficacité lumineuse. En ajoutant Airyscan 2 avec son mode Multiplex, vous obtenez davantage d'options d'imagerie pour vos expériences. Choisissez la configuration adaptée à une acquisition non invasive des images de champs d'observation plus larges avec une super résolution et des temps d'acquisition plus courts. Plusieurs fonctionnalités logicielles optimisent votre flux de travail pour une acquisition et une gestion des données efficaces.

Points forts

L'imagerie haut de gamme au service de vos recherches

Utilisez une multitude de marqueurs fluorescents de 380 nm à 900 nm.
Profitez de la flexibilité spectrale : jusqu'à 36 canaux simultanés.
Obtenez plus d'informations en moins de temps grâce à Airyscan 2 Multiplex.
Trouvez rapidement des régions d'intérêt avec AI Sample Finder.
Obtenez un réglage optimal de l'imagerie et du détecteur à l'aide de la fonction Smart Setup.
Élargissez vos recherches avec l'imagerie NLO, NIR, Cryo et SIM².

De meilleures données, plus rapidement

En mode Multiplex pour Airyscan 2, obtenez plus d'informations en moins de temps. Des systèmes d'éclairage et de détection intelligents capturent des images de vos échantillons 3D les plus complexes avec des fréquences d'images élevées, au-delà de la limite de diffraction et en ménageant vos échantillons sensibles. Grâce à la super résolution et à la flexibilité d'un microscope confocal à balayage point par point associée à la vitesse et à l'innocuité du détecteur de zone sensible Airyscan, il est désormais possible de répondre à vos questions scientifiques jusqu'à dix fois plus rapidement.

Image : cellules HeLa marquées pour l'ADN (bleu, Hoechst 44432), les microtubules (jaune, anti-tubuline Alexa 488) et la F-actine (magenta, phalloïdine Abberior STAR Red). Image obtenue avec ZEISS Airyscan 2 en mode Multiplex pour l'imagerie performante en super résolution d'un large champ d'observation. Avec l'aimable autorisation d'A. Politi, J. Jakobi et P. Lenart, MPI pour la chimie biophysique, Göttingen, Allemagne.

Cellules HeLa colorées pour l'ADN (bleu, Hoechst 44432), les microtubules (jaune, anti-tubuline Alexa 488) et la F-actine (magenta, phalloïdine Abberior STAR Red).

HeLa cellsCellules HeLa

Cellules Cos-7

Une image qui gagne en sensibilité

Le LSM 980 vous offre le meilleur de deux mondes pour capturer des images de vos échantillons les plus complexes. Vous bénéficiez de la trajectoire de faisceau performante de la famille LSM 9 qui propose jusqu'à 36 canaux simultanés pour une flexibilité spectrale totale atteignant la gamme du proche infrarouge (NIR). De plus, en association avec Airyscan 2, ce détecteur de zone révolutionnaire extrait davantage d'informations de votre échantillon, encore plus rapidement. Vous obtenez ainsi des images de signaux faibles avec un rapport signal/bruit (SNR) 4 à 8 fois plus élevé. Il n'est plus nécessaire de fermer un sténopé pour obtenir la super résolution, pour une illumination de votre imagerie 3D encore plus efficace.

Image : cellules Cos-7, DAPI (bleu) et anti-tubuline Alexa 700 (rouge). Image Alexa 700 acquise avec un détecteur NIR. Échantillon : avec l'aimable autorisation de Urs Ziegler et Jana Doehner, Université de Zurich, ZMB, Suisse.

Augmentez votre productivité

Mettre en place des expériences complexes d'imagerie confocale de cellules vivantes n'a jamais été aussi facile. Le logiciel de microscopie ZEN offre une multitude de fonctionnalités pour vous aider à obtenir des résultats reproductibles dans les plus brefs délais.

AI Sample Finder vous accompagne pour détecter rapidement les régions d'intérêt et vous fait gagner un temps précieux qui profite à vos expériences. Avec Smart Setup, utilisez les paramètres d'imagerie optimaux pour vos marqueurs fluorescents. Le traitement direct permet l'acquisition d'image et le traitement des données en parallèle. ZEN Connect vous confère un contrôle total, aussi bien pendant l'imagerie que plus tard, lorsque vous partagez l'historique de vos expériences.

ZEN BioApps : transformez vos images en données précieuses – analysez vos images avec pertinence.

Le principe Airyscan

Les microscopes confocaux à balayage laser classiques utilisent un éclairage point par point pour balayer l'échantillon de manière séquentielle. L'optique du microscope transforme chaque point en un disque d'Airy étendu (tache d'Airy). Un sténopé limite ensuite ce disque d'Airy dans l'espace pour empêcher la lumière hors foyer d'atteindre le détecteur. La fermeture du sténopé offre une meilleure résolution, mais au prix d'une détection moindre des photons, qui ne peuvent par exemple pas être restitués par déconvolution.

L'Airyscan 2 est un détecteur de zone comportant 32 éléments de détection disposés concentriquement. Il permet donc d'acquérir une plus grande partie du disque d'Airy en une seule fois. Le sténopé confocal lui-même reste ouvert et ne bloque pas le passage de la lumière, ce qui améliore la collecte des photons. L'efficacité lumineuse lors de l'imagerie est donc bien supérieure. Airyscan 2 vous offre une combinaison unique d'imagerie non invasive à super résolution et de haute sensibilité.

Fonctionnement du nouveau mode Multiplex pour Airyscan 2

La gamme LSM 9 avec Airyscan 2 de ZEISS vous offre désormais plus d'options pour adapter les vitesses d'imagerie et la résolution selon les contraintes de vos expériences. Vous combinez un détecteur de zone confocal avec des schémas d'éclairage et de lecture intelligents qui vous permettent de choisir parmi différentes options de parallélisation. Le nouveau mode Multiplex utilise les connaissances sur la forme du spot laser d'excitation et sur l'emplacement des différents éléments du détecteur de zone pour extraire plus d'informations spatiales, même pendant la lecture simultanée de pixels. Il est ainsi possible d'effectuer de plus grands pas lors du balayage du laser d'excitation sur le champ d'observation, ce qui améliore les vitesses d'acquisition réalisables.

En effet, la grande quantité d'informations spatiales capturées dans le plan du sténopé permet de reconstituer une image finale avec une meilleure résolution que l'échantillonnage d'acquisition. Airyscan 2 en mode Multiplex peut acquérir jusqu'à quatre lignes d'images en super résolution avec un rapport signal/bruit élevé en un seul balayage. Votre LSM 980 avec Airyscan 2 étire le spot laser d'excitation pour effectuer une acquisition d'images sur huit lignes en parallèle. Utilisez cet avantage de vitesse pour les séries temporelles ultrarapides de coupes uniques, pour la juxtaposition rapide de larges zones ou pour l'imagerie volumétrique rapide en différé.

Visionnez la bande-annonce sur l'animation du mode Multiplex

LSM 980	Airyscan SR	Multiplex SR-4Y	Multiplex SR-8Y	Multiplex CO-8Y
Parallélisation	1	4	8	8
Résolution	120/120	140/140	120/160	Confocal ou mieux
Vitesse maximale par seconde au champ d'observation maximal	0,2 (Zoom 1,7)	1,0 (Zoom 1)	2,0 (Zoom 1)	9,6 (Zoom 1)
Immunomarquage, structures fines	+++++	++++	+++	++
Immunomarquage, juxtaposition	++	++++	++++	+++
Imagerie des cellules vivantes	++	+++	++++	+++++

Imagerie à infrarouge proche (NIR)

Élargissez votre plage spectrale

Élargir votre plage spectrale dans l'infrarouge proche vous permet d'utiliser en parallèle un plus grand nombre de marquages. Dans vos expériences multicolores, visualisez des structures supplémentaires avec plus de colorants, grâce aux détecteurs Quasar et NIR qui prennent efficacement en charge les expériences de multiplexage spectral. Les marquages fluorescents NIR sont moins phototoxiques pour les échantillons vivants en raison de leur longueur d'onde plus grande. Vous avez donc la possibilité d'étudier des échantillons vivants pendant de plus longues périodes en limitant l'influence de la lumière. En outre, la lumière de plus grandes longueurs d'onde est moins diffusée par l'échantillon de tissu, ce qui augmente la profondeur de pénétration.

Pour les nombreux avantages que vous recherchez avec les marquages NIR, le détecteur NIR à double canal combine deux technologies de détection (GaAsP et GaAs à rouge étendu) pour une sensibilité optimale jusqu'à 900 nm.

Rendement quantique spectral typique (QE) des détecteurs ZEISS LSM 980, y compris le NIR.

Cellules Cos-7, DAPI (magenta), anti-tubuline Alexa 568 (bleu), actine phalloïdine OG488 (jaune) et Tom20-Alexa 750 (rouge). Image acquise en mode Lambda à travers le spectre visible et NIR. Signaux individuels séparés par ségrégation linéaire. Projection de l'intensité maximale de la pile Z.
Échantillon : avec l'aimable autorisation de Urs Ziegler et Jana Doehner, Université de Zurich, ZMB, Suisse.

Microtubules de la cellule Cos-7 (Anti-Tubuline AF700). Comparaison du MA-PMT ZEISS LSM 980 et du détecteur NIR GaAsP ZEISS ; excitation avec un laser de 639 nm à la même puissance laser. La plage d'émission pour le photomultiplicateur MA est réglée sur 660 – 757 nm, et pour le détecteur NIR sur 660 – 900 nm.
Échantillon : avec l'aimable autorisation de Urs Ziegler et Jana Doehner, Université de Zurich, ZMB, Suisse.

Microscopie multiphotonique avec LSM 980 NLO

La microscopie multiphotonique (microscopie à deux photons, microscopie optique non linéaire, NLO) est une méthode privilégiée pour l'imagerie tissulaire non invasive et profonde d'échantillons vivants ou fixés, notamment en neurosciences. La microscopie multiphotonique s'appuie sur la moindre absorbance et diffusion par les tissus des grandes longueurs d'onde (600 à 1300 nm), qui pénètrent donc plus profondément dans l'échantillon en formant un point focal. L'énergie nécessaire pour exciter un colorant fluorescent n'est pas fournie par un seul photon, mais par deux photons apportant chacun la moitié de l'énergie. La probabilité que deux photons atteignent le fluorophore en même temps n'est suffisante qu'au point focal. C'est pourquoi la lumière d'émission provient du plan focal et peut être efficacement détectée, générant une section optique sans sténopé.

Diagramme énergétique de la microscopie à deux photons

Combiner les capacités confocales et multiphotoniques

Un microscope à balayage laser qui dispose de capacités confocales et multiphotoniques vous donne accès aux deux technologies pour s'adapter au mieux à vos expériences :

Combinez une pénétration profonde des tissus avec une sensibilité, une résolution et une vitesse accrues.
Réduisez l'exposition à la lumière et obtenez des séparations claires de tous les signaux d'émission.
Collectez efficacement la lumière grâce à des détecteurs GaAsP NDD haute sensibilité et proches du signal.
Visualisez des structures non colorées à l'aide de l'excitation multiphotonique par génération de deuxième ou troisième harmonique (SHG, THG).

Image de vascularisation du cerveau du poisson zèbre en orientation coronale. Image acquise au moyen de l'excitation du laser à deux photons à 1000 nm. La lumière d'émission a été capturée avec le détecteur GaAsP BiG.2 non descanné. Code couleur de la pile Z de 293 µm. Échantillon : avec l'aimable autorisation de la Fish Facility, Institut Leibniz pour la recherche sur le vieillissement - Institut Fritz Lipmann e.V. (FLI), Jena, Allemagne.

Tranche de cerveau de souris avec marquage GFP cytoplasmique neuronal. Le volume de 100 µm a été acquis par excitation laser à deux photons à 1000 nm avec le détecteur non descanné GaAsP BiG.2. L'ensemble de données a été codé en couleur pour la profondeur et une projection orthogonale a été créée avec ZEN blue. Échantillon : avec l'aimable autorisation du Prof. J. Herms, LMU, Munich, Allemagne.

Applications

ZEISS LSM 980 en action

Méiose dans des ovocytes d'étoiles de mer
Le codage de la profondeur montre un sous-ensemble de 52 μm. Le film montre le transport des chromosomes, marqués par l'Histone 1-Alexa 568, dans un ovocyte d'étoile de mer en cours de méiose. Une pile z de 67 μm a été acquise toutes les 2,4 secondes avec le mode Airyscan CO-8Y. Parallèlement au transport des chromosomes, le nucléole (la grande structure sphérique) se désassemble.

Méiose dans des ovocytes d'étoiles de mer
Le rendu est une projection du processus le long de l'axe z (intensité maximale) et du temps (projection avec code de couleur) ; pour illustrer le mouvement des chromosomes dans le volume du noyau. © Avec l'aimable autorisation de P. Lenart, MPI pour la chimie biophysique, Göttingen, Allemagne.

Les ovocytes stockent tous les nutriments nécessaires au développement précoce de l'embryon. Il s'agit donc de très grandes cellules comportant un gros noyau qui doivent se diviser avant la fécondation. Le laboratoire de P. Lenart étudie le fonctionnement de la division cellulaire dans cette cellule de très grande taille.
Les chercheurs ont montré que, étonnamment, un réseau d'actine était nécessaire pour rassembler les chromosomes dispersés dans le noyau de l'ovocyte. Ils sont ensuite transmis aux microtubules, qui capturent les chromosomes et les alignent sur le fuseau. Les phases de transport entraînées par l'actine et les microtubules s'effectuent à des vitesses très différentes et présentent d'autres caractéristiques de différenciation identifiables en suivant le mouvement des chromosomes.

C'est un beau défi d'imagerie, car les chromosomes sont dispersés dans le noyau sphérique de 80 μm de diamètre et transportés pendant une quinzaine de minutes. En 2005, nous pouvions acquérir des piles toutes les 45 secondes, un laps de temps suffisant pour distinguer les phases pilotées par l'actine et par les microtubules. En utilisant les nouvelles trajectoires à haute résolution présentées ici, nous espérons apprendre les détails du mécanisme de transport.
Peter Lenart

Explant tissulaire épendymaire provenant du système ventriculaire d'un cerveau de souris

Ce projet ZEN Connect documente l'expérience réalisée avec l'explant tissulaire épendymaire du système ventriculaire d'un cerveau de souris. Toutes les données acquises lors de la session d'expérimentation sont conservées en contexte. Les images d'ensemble obtenues par caméra et microscope à balayage laser permettent d'enregistrer précisément la localisation du battement ciliaire acquis dans l'échantillon. La carte du flux généré par les cils le long de la paroi épendymaire est ajoutée comme référence.

Aperçu des cils mobiles marqués par fluorescence sur un explant tissulaire épendymaire du cerveau de la souris

Une vue d'ensemble des cils mobiles marqués par fluorescence sur l'explant tissulaire épendymaire du cerveau de la souris est rapidement acquise grâce à la juxtaposition avec Airyscan 2 en mode Multiplex CO-8Y pour trouver des régions d'intérêt. Pile Z affichée avec un code de profondeur coloré. La position exacte des cils mobiles enregistrés est documentée.

Imagerie en direct avec 143 images par seconde des cils mobiles marqués par fluorescence de l'épendyme du cerveau. Images acquises au moyen du mode Airyscan CO-8Y combinant qualité et rapidité d'image pour une analyse détaillée de la direction et de la fréquence des battements ciliaires. © Avec l'aimable autorisation de G. Eichele, Institut Max Planck de chimie biophysique, Göttingen, Allemagne.

Les ganglions cérébraux, thoraciques et abdominaux du cafard sont reliés entre eux par des faisceaux conjonctifs bilatéraux d'interneurones ascendants et descendants formant la chaîne nerveuse ventrale. Dans cette préparation, les connectifs gauche et droit ont été marqués individuellement (Alexa 488 : vert, Alexa 647 : magenta) en arrière du ganglion sous-œsophagien pour observer l'extension de leur innervation au sein des différents neurophiles, et dans l'ensemble des parties ipsi et contralatérales du cerveau (ADN marqué au DAPI : cyan). L'imagerie a été réalisée à l'aide de la méthode de juxtaposition et d'assemblage pour capturer le volume total (3 × 2,3 × 0,26 mm). L'animation 3D de l'ensemble des données a été réalisée avec arivis Vision 4D, idéal pour le rendu et l'analyse de grands ensembles de données. La visionneuse 4D d'arivis Vision 4D peut être configurée pour ajuster indépendamment l'apparence de chaque canal et mettre en évidence des caractéristiques spécifiques.

Ces paramètres, ainsi que les plans d'écrêtage ou l'opacité variable des canaux individuels, peuvent être stockés dans des images clés que le logiciel interpole automatiquement pour produire une animation lisse et continue. Ces animations peuvent être prévisualisées et modifiées avant de produire un rendu vidéo en haute résolution.

Le poisson zèbre est un modèle bien établi pour étudier le développement du système vasculaire. L'imagerie multiphotonique s'avère un excellent moyen de capturer les schémas vasculaires complexes du cerveau du poisson zèbre à une grande profondeur. De plus, grâce à la génération de deuxième harmonique (SHG), les informations structurelles des tissus environnants peuvent être capturées sans qu'un marquage supplémentaire ne soit nécessaire.

Système vasculaire du cerveau et des yeux du poisson zèbre (vert) et génération de deuxième harmonique (gris) en orientation sagittale. Un volume de 267 μm a été acquis avec le laser à deux photons à 1000 nm et l'émission a été détectée avec le détecteur GaAsP BIG.2. La SHG a permis de visualiser les structures tissulaires, telles que les cellules de la rétine et les muscles oculaires. Échantillon : avec l'aimable autorisation de la Fish Facility, Institut Leibniz pour la recherche sur le vieillissement - Institut Fritz Lipmann e.V. (FLI), Jena, Allemagne.

NIR : augmenter le nombre de marqueurs
Pour capturer le monde complexe de la biologie, la possibilité d'augmenter le nombre de marqueurs est un avantage considérable. Le LSM 980 peut acquérir simultanément l'image de plusieurs marqueurs, couvrant une large gamme d'émissions jusqu'à 900 nm. Ces cellules Cos-7 ont été marquées avec 4 fluorophores différents, dont deux ont leur pic d'émission dans le proche infrarouge (NIR), Alexa 700 et Alexa 750. Grâce à l'utilisation du LSM 980 Quasar et de détecteurs NIR, tous les marqueurs ont été représentées avec une sensibilité optimale.

Cellules Cos-7 Anti-TOM20 AF750 (rouge), anti-tubuline AF568 (cyan), actine phalloïdine-OG488 (magenta), DAPI (jaune). Image acquise avec le LSM 980 incluant le détecteur NIR de ZEISS en mode canal. La séparation des signaux fluorescents par ségrégation linéaire a permis une distinction claire des colorants Alexa 700 et 750, dont les spectres se chevauchent.

Échantillon : avec l'aimable autorisation de Urs Ziegler et Jana Doehner, Université de Zurich, ZMB, Suisse.

Navigation et corrélations en toute simplicité
Le monde de la microscopie passe progressivement à des échantillons plus grands, d'où l'importance croissante de maintenir le contexte positionnel et de conserver un enregistrement des zones capturées. AI Sample Finder classe automatiquement le porte-échantillon, identifie l'échantillon, effectue la mise au point et crée une image d'ensemble rapide à l'aide du photomultiplicateur ou de la caméra. Naviguez librement en utilisant l'image d'ensemble pour vous orienter et vous déplacer sans effort vers les structures intéressantes. Vous consacrez ainsi votre temps à imager uniquement les régions qui contiennent des informations pertinentes pour vos recherches. ZEN Connect met en corrélation toutes les données associées à l'échantillon.

Dans cet exemple, le tissu intestinal de la souris a été marqué avec trois fluorophores couvrant un spectre d'émission de 500 à 850 nm. AI Sample Finder a automatiquement identifié le support et a créé une image d'ensemble avec le photomultiplicateur T pour capturer le marqueur Alexa 488. L'image d'ensemble permet la navigation dans l'échantillon et l'identification des régions d'intérêt. ZEISS LSM 980 Quasar et les détecteurs NIR ont été utilisés pour acquérir des images des marqueurs visibles et invisibles avec une sensibilité optimale.

Coupe tissulaire d'un intestin de souris

Coupe tissulaire colorée d'un intestin de souris pour la substance P (cyan, Alexa 488) marquant les contacts présynaptiques dans le système nerveux entérique, HuC/D (jaune, Alexa 568) marquant les neurones entériques, et la synthase d'oxyde nitrique neuronale (nNOS, rouge, Alexa 750) marquant une sous-population de neurones entériques. Échantillon : avec l'aimable autorisation de Pieter Vanden Berghe, LENS & CIC, Université de Louvain, Belgique.

La microscopie multiphotonique peut être combinée avec la juxtaposition et l'assemblage 3D afin d'obtenir des images de grands échantillons, comme cet exemple de cervelet de souris. L'imagerie Airyscan 2 en mode super résolution permet d'acquérir des images en super résolution de zones d'intérêt spécifiques et se combine facilement avec l'imagerie à deux photons. ZEN Connect rassemble toutes les informations issues de vos diverses expériences. Vous pouvez ainsi cartographier des images en haute résolution sur la structure plus large, en conservant le contexte et en simplifiant l'organisation de vos fichiers.

Cervelet de souris marqué avec l'anticorps calbindin (Alexa-568) et anti-GFAP (Alexa-488).

Cervelet de cerveau de souris marqué avec de l'anti-calcaire (Alexa-568) et de l'anti-GFAP (Alexa-488). Les deux fluorophores ont été excités par le laser à deux photons à 780 nm et les spectres d'émission ont été collectés simultanément par le détecteur BIG.2. La juxtaposition et l'assemblage 3D ont été utilisés pour couvrir l'ensemble de la structure et une projection orthogonale a été créée dans ZEN Blue. Des zones d'intérêt spécifiques ont été imagées à l'aide du détecteur Airyscan 2 afin d'acquérir des images haute résolution des cellules de Purkinje. Après le traitement des enregistrements de données Airyscan 2, ZEN Blue a créé des projections orthogonales. Zen Connect a aligné les images individuelles en super résolution avec le cervelet. Avec l'aimable autorisation de L. Cortes, Université de Coimbra, Portugal.