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Produits recommandés pour l'imagerie 3D et l’imagerie hors plan focal

Coupe optique

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Imagerie 3D

Un modèle visuel complet pour appuyer vos recherches

Tous les échantillons biologiques sont en trois dimensions, depuis les organites jusqu'aux bactéries, couches de cellules somatiques, coupes de tissus et petits modèles d'organismes. La microscopie de fluorescence offre la puissante possibilité de marquer spécifiquement les protéines, les structures et les organites. Toutefois, lorsque vous capturez l'image de ces cibles au sein de l'échantillon, l'émission de fluorescence se produit depuis les deux directions au-dessus et au-dessous du plan focal pour être ensuite capturée par l'objectif. Cet effet rend l'image résultante floue et entraîne une diminution de la résolution. Les méthodes d'imagerie 3D modernes comme la coupe optique vous aident à obtenir de  superbes  images en trois dimensions des échantillons fluorescents. Les techniques d'imagerie 3D s'appuient généralement sur des algorithmes mathématiques, du matériel optique ou une combinaison des deux pour supprimer ou réduire au minimum la fluorescence hors-plan focal.

Techniques d'imagerie 3D pour la coupe optique en microscopie optique

  • La déconvolution est une méthode d'imagerie 3D qui emploie des modèles mathématiques. Avec la déconvolution, vous restaurez des images floues par une réaffectation mathématique de la lumière diffuse vers son point d'origine. Utilisant toute la lumière émise dans et hors du plan focal, cette méthode de coupe optique est très sensible et idéale pour les échantillons à faible fluorescence et l'imagerie cellulaire en direct. Avec le module Deconvolution de ZEN, vous appliquez facilement la coupe optique aux images de fluorescence à champ large.
  • L'éclairage structuré avec ApoTome.2 se base sur une structure de grille qui est projetée sur le plan focal et qui est déplacée avec une très grande précision. Un algorithme breveté calcule une coupe optique à haute résolution d'au moins trois images uniques avec des positions de grille différentes. Faites l'acquisition d'images 3D multicanales des coupes tissulaires et d'animaux entiers. Insérez simplement ApoTome.2 dans la position d'arrêt du champ de votre microscope ZEISS et obtenez d'étonnants résultats d'imagerie 3D.
  • La corrélation d'ouverture combine le rendement lumineux de l'éclairage structuré avec la vitesse du spinning disk dans le VivaTome. La lumière d'excitation et d'émission est dirigée à travers le spinning disk muni d'un quadrillage situé dans un plan conjugué. Grâce à une transmission d'excitation optimisée à travers le disque, un rendement lumineux élevé est obtenu avec une simple source de lumière blanche. La lumière d'émission provenant du plan focal avec 50 % de la lumière hors plan focal passe à travers le disque et est détectée. Les 50 % restants de la lumière hors plan focal sont réfléchis par le disque et capturés pour créer une seconde image. Une soustraction de deux images produit rapidement la coupe optique. L'utilisation de la corrélation d'ouverture avec VivaTome vous permet ainsi acquérir des images de processus dynamiques avec une fréquence d'image élevée et un excellent contraste.
  • La microscopie confocale utilise l'éclairage ponctuel et un pinhole dans un plan conjugué du trajet de la lumière d'émission pour supprimer la lumière hors plan focal. Cette technique est un outil puissant pour les échantillons épais et atteint une haute résolution dans la direction z. Elle peut toutefois s'avérer difficile pour les petits échantillons qui n'émettent que peu de lumière. Les microscopes à balayage laser ZEISS LSM 710 et LSM 780 sont équipés de détecteur à forte sensibilité qui peuvent atteindre des rendements quantiques de l'ordre de 45 %. Capturez les images même de vos échantillons les plus difficiles avec un rapport signal-bruit exceptionnel et un temps d'exposition court. Pour une surveillance rapide et en douceur de vos échantillons vivants, optez pour Cell Observer SD. Cette solution d'imagerie 3D dispose la technologie du spinning disk. Avec de multiples pinholes sur un disque en rotation (spinning disk), vous pouvez acquérir des images confocales 3D avec des vitesses d'acquisition extrêmement élevées.
  • L'excitation sélective consiste à exciter uniquement les fluorophores dans le plan focal souhaité pour créer la coupe optique. Cela peut être réalisé à l'aide de la microscopie multiphoton avec LSM 7 MP ou l'additif NLO pour LSM 710 et 780. En utilisant des longueurs d'onde à faible énergie dans la gamme des infrarouges, deux photons sont nécessaires pour exciter un fluorophore. De ce fait, la fluorescence est principalement générée dans le plan focal, là où le faisceau laser est étroitement concentré. Les longueurs d'onde d'excitation employées permettent en outre de réduire la diffusion et la photodégradation. Vous obtenez des images jusqu'à une profondeur exceptionnelle d'un millimètre, tout en évitant les effets de blanchiment et phototoxiques. La microscopie de fluorescence à feuillet de lumière (LSFM) est une autre technique qui emploie l'excitation sélective. Le trajet de la lumière d'excitation est séparé du trajet de la lumière d'émission et éclaire exclusivement le plan focal de votre échantillon. Avec l'imagerie MultiView et l'incubation, vous surveillez facilement des embryons en développement et des tissus organiques avec Lightsheet Z.1 pendant plusieurs heures ou même plusieurs jours.

Microscopie de superrésolution 3D

La microscopie de superrésolution sous illumination structurée (SR-SIM) est une technique de fluorescence universelle et flexible qui met en œuvre l'acquisition 3D. Une grille à phase très fine de lumière laser cohérente est mise en rotation et déplacée au-dessus de votre échantillon pour exciter les fluorophores. En interférant avec le motif de la structure de votre échantillon, le motif d'éclairage superposé produit un troisième motif. Celui-ci est plus large que le motif fin découlant des petites structures de votre échantillon et peut donc être transmis par la lentille. L'image de superrésolution est ensuite calculée à partir de cette information. Vous améliorer ainsi la résolution latérale et notamment axiale. Avec ELYRA S.1 et ELYRA PS.1, vous obtenez d'impressionnants résultats d'imagerie 3D avec un fluorophore conventionnel. Vous doublez la résolution de la microscopie optique conventionnelle et effectuez des coupes z pour l'acquisition 3D.

Imagerie 3D en microscopie électronique

La microscopie électronique à balayage est capable d'acquérir des images de microstructures biologiques dans des  résolutions étonnantes qui peuvent être combinées avec l'imagerie 3D. Les échantillons sont enrobés dans une résine et puis découpés physiquement en tranches avec un ultramicrotome à l'intérieur de la chambre à échantillon. Après chaque tranche, le bloc de l'échantillon est imagé, créant ainsi une série séquentielle d'images de microscopie électronique que vous recombinez en un ensemble de données final en trois dimensions. Cette technique, également appelée « serial block-face imaging » (SBF-SEM), est mise en œuvre dans les microscopes électroniques à balayage ZEISS MERLIN 3View et SIGMA 3View en utilisant la technologie SBF-SEM rapide et pratique par Gatan. Une autre possibilité est l'utilisation d'un faisceau ionique focalisé, mise en œuvre dans la station de travail FIB-SEM CrossBeam de ZEISS pour enlever par usinage la surface de votre échantillon et la reconstruire avec le logiciel ATLAS 3D. Bien que l'approche avec l'ultramicrotome soit une méthode plus rapide, le faisceau ionique concentré permet d'obtenir une épaisseur de tranche beaucoup plus fine.

Le didacticiel suivant commence par une image à champ large pseudo-colorée en vert de l'échantillon qui apparaît dans la fenêtre Widefield Image et une version en niveaux de gris dans la fenêtre Raw Image. Pour utiliser le didacticiel, cliquez sur le bouton AutoPlay ou utilisez le curseur de la souris pour cliquer sur l'un des boutons Modulation Angle. Les différentes orientations de la grille apparaîtront superposées à l'image brute et le spectre de puissance associé s'affichera dans la fenêtre Fourier Spectrum. Une fois que les 5 ensembles d'images sont capturés, l'image reconstruite à haute résolution apparaîtra dans la fenêtre Superresolution-SIM Image.

 

Didacticiel : Microscopie de superrésolution sous illumination structuréeDidacticiel : Microscopie de superrésolution sous illumination structurée
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